코로나바이러스 복제-전사 복합체: nsp9의 보존된 사이트에 대한 NiRAN-RdRp 하위 단위의 중요하고 선택적인 NMPylation

편집자: Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, 2020년 12월 25일 승인(검토일: 2020년 10월 25일)

우리는 복제 및 진화 보존에 필수적인 코로나바이러스 전사 복합체의 복제에서 하위 단위 간의 상호 작용을 보고합니다.우리는 nsp12와 관련된 NiRAN 도메인이 트랜스에서 뉴클레오시드 모노포스페이트(NMP) 트랜스퍼라제 활성을 가지고 있다는 증거를 제공하고 nsp9(RNA 결합 단백질)를 표적으로 식별했습니다.NiRAN은 Mn2+ 이온 및 인접한 보존된 Asn 잔기에 의존하는 반응에서 보존된 nsp9 아미노 말단에 대한 NMP 부분의 공유 부착을 촉매합니다.NiRAN 활동과 nsp9 NMPylation이 코로나바이러스 복제에 필수적인 것으로 밝혀졌습니다.데이터를 통해 우리는 중첩된 바이러스 효소 마커의 이러한 활동을 RNA 바이러스 클래스에서 RNA 합성의 시작이 기능적으로나 진화적으로 일관된다는 가설의 이전 관찰과 연결할 수 있습니다.

Nidovirales(Coronaviridae, Arterioviridae 및 기타 12개 과)의 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRps)는 NiRAN이라고 불리는 다단백질에서 방출된 비구조 단백질(nsp)의 아미노 말단(N 말단) 도메인에 연결되어 있습니다. 1ab는 바이러스성 주요 프로테아제(Mpro)로 구성됩니다.이전에는 동맥 바이러스인 NiRAN-RdRp nsp 자체의 GMPylation/UMPylation 활성이 보고되었으며, (현재 알려지지 않은) 바이러스 및/또는 세포 생체중합으로의 뉴클레오시드 모노포스페이트(NMP)의 전달을 위한 과도 현상을 생성하는 것이 제안되었습니다.여기서 우리는 코로나바이러스(인간 코로나바이러스[HCoV]-229E 및 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2) nsp12(NiRAN-RdRp)가 Mn2+ 의존성 NMPylation 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 이는 Mpro 매개 nsp9 형성을 통해 nsp9에서 파생됩니다. N 말단 측면 nsps는 단백질 분해적으로 방출되고, 포스포라미데이트는 nsp9의 N 말단에서 1차 아민(N3825)에 결합됩니다.우리딘 삼인산이 이 반응에서 선호되는 뉴클레오티드이지만, 아데노신 삼인산, 구아노신 삼인산 및 시티딘 삼인산도 적합한 보조 기질입니다.재조합 코로나바이러스 nsp9 및 nsp12 단백질과 유전적으로 조작된 HCoV-229E 돌연변이를 사용한 돌연변이 연구는 세포 배양에서 NiRAN 매개 nsp9 NMPylation 및 바이러스 복제에 필요한 잔기를 결정했습니다.데이터는 NiRAN 활성 부위 잔기의 예측을 확인하고 시험관 내에서 nsp9 NMPylation 및 바이러스 복제에서 nsp9 N3826 잔기의 중요한 역할을 결정했습니다.이 잔기는 보존된 N-말단 NNE 트리펩타이드 서열의 일부이며 코로나바이러스 계열에서 nsp9 및 그 동족체의 유일한 불변 잔기인 것으로 입증되었습니다.이 연구는 다른 중첩 바이러스의 NMPylation 활동에 대한 기능적 연구를 위한 견고한 토대를 제공하고 항바이러스 약물 개발을 위한 가능한 목표를 제안합니다.

Nidovirales 양성 가닥 RNA 바이러스는 다양한 척추동물과 무척추동물을 감염시킵니다(1, 2).명령에는 현재 14개 계열(3개)이 포함되어 있으며, 그 중 코로나바이러스 계열은 지난 20년 동안 광범위하게 연구되었습니다.당시 동물 숙주로부터 3종의 인수공통 코로나바이러스가 출현해 인간에게 심각한 호흡기 감염을 대규모로 발생시켰다.심각한 급성 전염병으로 인한 지속적인 유행병을 포함합니다.호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)(4ââ7).니도바이러스는 공통 게놈 조직을 공유하며 막 결합 복제-전사 복합체(RTC)의 하위 단위는 5-Ω² 말단 2/3와 바이러스 입자의 주요 구조 하위 단위 및 일부 액세서리에 암호화되어 있습니다. .게놈의 3??² 끝 1/3에 암호화된 단백질(1).플라나리아 바이러스(Monoviridae)의 한 계열(8)을 제외하고 모든 내포된 바이러스는 두 개의 큰 개방형 판독 프레임(ORF) ORF1a 및 ORF1b의 RTC 하위 단위를 암호화하며 이는 게놈 RNA에서 번역됩니다.ORF1a는 다단백질(pp) 1a를 인코딩하고, ORF1a와 ORF1b는 공동으로 pp1ab를 인코딩합니다.ORF1a에 의해 암호화된 주요 프로테아제(Mpro)의 일반적인 참여로 pp1a와 pp1ab는 모두 단백질 분해에 의해 다양한 비구조 단백질(nsps)로 가공되며, 이는 피코나바이러스의 3Cpro와 상동성을 가지기 때문에 3CLpro라고도 알려져 있습니다. 9).이러한 nsps는 대규모 동적 RTC로 조립되어 게놈 RNA(복제) 및 하위 게놈 RNA 세트(전사)의 합성을 촉매하고 ORF1b의 하류에 위치한 ORF(10? ?12).

핵심 RTC에는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RdRp)(13), 슈퍼패밀리 1 헬리카제(HEL1)(14, 15) 및 주로 ORF1b 및 코로나바이러스 패밀리에 인코딩된 여러 RNA 처리 효소 nsp12-nsp16 및 Arterioviridae 계통의 nsp9-nsp12(참조 10~12 참조).RdRp와 HEL1은 새둥지 바이러스의 2개(5분의 1) 보존된 도메인을 나타내며 다른 RNA 바이러스와 상동성을 갖습니다.코어 복제효소는 Mpro 하류에 있는 pp1a의 카르복시 말단(C 말단) 영역에서 방출된 여러 개의 작은 nsp(각각 코로나바이러스 nsp5 및 동맥 바이러스 nsp4)를 포함한 다른 하위 단위의 도움을 받는 것으로 여겨집니다.그들은 가족별 보호와 다양한 활동이 제한되어 있습니다(참조 10-12에서 검토됨).

비교적 최근에는 모든 중첩 바이러스에서 RdRp에 인접한 아미노 말단(N-말단)에서 독특한 서열 모티프 특성을 갖는 도메인이 발견되었지만 다른 RNA 바이러스는 발견되지 않았습니다(16).위치와 뉴클레오티드 전이효소(뉴클레오시드 모노포스페이트[NMP] 전이효소) 활성을 기반으로 이 도메인은 NiRAN(Nestvirus RdRp 관련 뉴클레오티드 전이효소)으로 명명됩니다.NiRAN-RdRp의 이중 도메인 조합은 Coronaviridae 계열의 nsp12와 Arterioviridae 계열의 nsp9를 구성하며, 다른 Nestoviridae에서는 NiRAN-RdRp가 바이러스 다단백질로부터 독립적인 nsp로 방출될 것으로 예상됩니다.코로나바이러스에서 NiRAN 도메인은 ??1/450 잔기를 포함하며 링커 영역(16?19)을 통해 C 말단 RdRp 도메인에 연결됩니다.말 동맥염 바이러스(EAV)(Arteriviridae)에서 재조합 nsp9는 네스토바이러스, AN, BN 및 CN의 세 가지 보존된 서열 염기에 의존하는 Mn2+ 이온 의존적(자가) UMPylation 및 GMPylation 활성을 보여줍니다.여기서 N은 NiRAN을 나타냅니다)(16).이러한 모티프의 N-말단 측면은 덜 보수적인 모티프 preAN입니다.이들 잔기 중 일부는 먼 관련이 있는 단백질 키나제에도 보존되어 있으며, 여기서 뉴클레오시드 삼인산(NTP) 결합 및 촉매 활성에 관여하는 것으로 나타났습니다(20, 21).이러한 관찰과 일치하여, 슈도모나스 주사기(Pseudomonas syringae)의 슈도키나제 SelO의 여러 주요 활성 부위 잔기는 최근 발표된 SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 수퍼복합체와 조립될 수 있습니다.전자 미세구조에 겹쳐진 보존된 코로나바이러스 NiRAN 잔기.재조합 단백질(17).문서화된 (자체) U/GMPylation은 NMP를 (현재 알려지지 않은) 기질로 전달하기 위한 일시적인 상태를 생성할 것으로 추측되며(16) NiRAN과 단백질 키나제 사이의 구조적 유사성은(17, 19) 다음과 같은 가설입니다. NiRAN은 다른 단백질을 변형합니다.

중첩된 바이러스와의 독특하고 독특한 체계적 연관 및 RdRp로부터의 유전적 분리를 포함한 많은 기능을 통해 NiRAN은 중첩된 바이러스에 대한 합리적인 주요 규제 효소가 되며, 이는 바이러스의 출현과 정체성에 매우 중요합니다.이전에는 게놈/하위 게놈 번역 또는 복제/전사를 조절하기 위해 NiRAN과 관련된 세 가지 가능한 기능이 호출되었습니다.당시 이용 가능한 희소하고 불완전한 데이터를 고려할 때 각 기능에는 장점과 단점이 있습니다(16).이 연구에서 우리는 두 속을 대표하는 코로나바이러스에 대한 생화학적 연구와 역유전적 연구를 결합하고 우리의 연구 결과를 코로나바이러스 계열의 자연적 돌연변이의 진화적 배경에 두어 이 신비한 영역에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로 합니다.우리는 중첩된 바이러스 RNA의 합성을 시작하는 데 있어 이 도메인의 역할에 기여하는 RTC의 자연 표적 식별을 통해 NiRAN에 대한 이해가 크게 향상되었음을 보고합니다.이 연구는 또한 바이러스 호스트 인터페이스에서 NiRAN의 다른 역할에 대한 가능성을 열어줍니다.

코로나 바이러스 nsp12 관련 NiRAN 도메인의 효소적 특성을 특성화하기 위해 우리는 C-말단에 His6 태그가 있는 재조합 형태의 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E) nsp12를 대장균에서 생산하고 재료 및 방법에 설명된 대로 MnCl2가 있는 상태에서 NTP와 함께 [α32-P] 단백질을 배양합니다.반응 생성물의 분석은 nsp12(106 kDa)와 함께 이동하는 방사성 표지 단백질의 존재를 나타냈으며, 이는 코로나바이러스 nsp12가 유리딘 모노포스페이트(UMP)로 우선적으로 형성된 공유 단백질-NMP 부가물의 형성을 촉매한다는 것을 나타냅니다(그림 1A). 비).정량 분석 ​​결과, 다른 뉴클레오티드와 비교하여 UMP 혼입의 신호 강도가 2~3배 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1C).이 데이터는 코로나바이러스의 NiRAN 도메인의 예측된 NMP 트랜스퍼라제 활성과 일치하지만(16), 코로나바이러스의 NiRAN 도메인과 동맥 바이러스의 뉴클레오티드 선호도가 다르다는 것을 나타냅니다.

HCoV-229E nsp12의 자가 NMPylation 활성.(A) HCoV-229E nsp12-His6(106 kDa)을 지정된 [α-32P] NTP와 함께 6 mM MnCl2 존재 하에 30분 동안 배양했습니다(자세한 내용은 재료 및 방법 참조).반응 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다.(B) 방사성 표지된 단백질은 인 이미징에 의해 시각화됩니다.nsp12-His6 및 단백질 분자 질량 마커(킬로달톤 단위)의 위치는 A와 B에 표시됩니다. (C) 방사성 신호의 강도(평균 ± SEM)는 3개의 독립적인 실험을 통해 결정되었습니다.* P ≤0.05.신호 강도(백분율)는 UTP와 관련이 있습니다.

NiRAN 관련 효소 활성이 세포 배양에서 EAV 및 SARS-CoV의 복제에 필수적인 것으로 나타났지만(16), 구체적인 NiRAN 기능과 잠재적인 목표는 아직 결정되지 않았습니다.최근에 보고된 NiRAN과 단백질 키나제 유사 접힘을 갖는 단백질 계열(17, 22) 사이의 구조적 유사성은 NiRAN이 다른 단백질의 NMPylation을 촉매한다는 가설을 테스트하도록 촉발했습니다.우리는 각각 C-말단 His6 태그를 포함하는 HCoV-229E ORF1a(nsps 5, 7, 8, 9, 10)에 의해 인코딩된 비구조 단백질을 포함하는 잠재적인 상동성 표적 세트를 생성했습니다(SI 부록, 표 S1). nsp12의 존재 또는 부재 하에서 이러한 단백질을 [α32-P] 우리딘 삼인산([α32-P]UTP)과 함께 배양합니다.대장균에서 생산된 소 혈청 알부민과 MBP-LacZα 융합 단백질은 대조군 역할을 했습니다(그림 2A, 레인 1~7).방사성 표지된 단백질을 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 방사능사진법으로 분석한 결과, nsp12와 nsp9가 포함된 반응에서 강한 방사성 신호가 있는 것으로 확인되었습니다.신호의 위치는 nsp9의 분자 질량에 해당하며, 이는 nsp9의 nsp12 매개 UMPylation을 나타냅니다(그림 2B, 트랙 7).다른 테스트 단백질은 UMPylated로 발견되지 않았으며, 이로 인해 nsp9가 nsp12의 특정 기질이라는 결론을 내릴 수 있었습니다.그림 1에 표시된 자가 NMPylation 데이터와 일치하게 nsp12는 4개의 NMP를 모두 nsp9로 전달할 수 있지만 효율성은 다르지만 UMP> 아데노신 모노포스페이트(AMP)> 구아노신 모노포스페이트(GMP)> 시티딘 모노포스페이트(CMP))( 그림).3A 및 B).이 분석에 사용된 조건(반응 및 노출 시간 단축, nsp12 농도 감소, 재료 및 방법)에서는 nsp12의 자가 NMPylation을 감지할 수 없었습니다(그림 2B, 레인 7 및 그림 1B 비교). 효과적인(그리고 여러 라운드) UMP가 nsp12에서 nsp9로 이동했음이 입증되었습니다.UMP 트랜스퍼라제 활성에는 그림 3C에 표시된 대로 Mn2+ 이온의 존재가 필요하지만, Mg2+가 있는 경우에는 최소한의 UMP 트랜스퍼라제 활성만 관찰되었으며 테스트된 다른 두 개의 2가 양이온이 있는 경우에는 활성이 없습니다.시티딘 삼인산(CTP), 구아노신 삼인산(GTP) 및 아데노신 삼인산(ATP)을 포함하는 NMPylation 분석에서도 유사한 데이터가 얻어졌습니다(SI 부록, 그림 S1).

HCoV-229E nsp12 매개 nsp9의 UMPylation.일련의 단백질 기질(소 혈청 알부민, MBP-lacZα 및 ORF1a에 의해 인코딩된 C-말단 His6으로 표지된 일련의 HCoV-229E nsps 포함)을 사용하여 HCoV-229E nsp12-His6⁺ 매개의 UMPylation 활성을 평가했습니다. 단백질.재료 및 방법에 설명된 대로 nsp12의 부재(A) 또는 존재(B)에서 10분 동안 [α-32P] UTP로 단백질을 배양합니다.A와 B의 상단에는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 젤이 표시되고, A와 B의 하단에는 해당 자가방사선 사진이 표시됩니다.단백질 분자 질량 마커의 위치(킬로달톤 단위)는 왼쪽에 표시되어 있습니다.nsp12-His6(B, 상단)의 위치와 nsp12-His6을 nsp9-His6(B, 레인 7)과 함께 인큐베이션하는 동안 관찰된 방사성 신호도 표시되어 있으며, 이는 [α-32P]UMP가 nsp9-His6에 있음을 나타냅니다. (12.9 kDa), 이는 테스트된 다른 단백질에서는 관찰되지 않았습니다.

HCoV-229E nsp9 NMPylation의 NiRAN 매개 생화학적 및 바이러스학적 특성 분석.(A 및 B) 반응에 사용되는 뉴클레오티드 공동 기질의 역할.Nsp12-His6 및 nsp9-His6은 표준 NMPylation 분석에서 서로 다른 [α-32P] NTP의 존재 하에 혼합되고 배양됩니다.(A, 상단) SDS-PAGE로 분리된 쿠마시 염색 nsp9-His6.(A, 하단) 젤의 동일한 부위에 대한 방사선 사진.(B) 지정된 뉴클레오티드 보조인자가 있는 경우의 상대 활성(평균 ± SEM)은 3개의 독립적인 실험을 통해 결정됩니다.* P ≤0.05.(C) 금속 이온의 역할.[α-32P] UTP와 다양한 금속 이온이 존재하는 경우 각각 1mM 농도의 표준 NMPylation 테스트가 표시됩니다.C에는 상단, 쿠마시 염색된 nsp9-His6이 표시되고 C에는 하단에 해당 자동 방사선 사진이 표시됩니다.표지된 단백질의 크기(킬로달톤 단위)는 A와 C의 왼쪽에 표시됩니다. (D) 지정된 아미노산 치환을 운반하는 HCoV-229E nsp12-His6의 돌연변이 형태는 설명된 대로 [α-32P]UTP에 있습니다. 재료 및 방법.NMPylation 반응에서 생성된 방사성 표지된 nsp9-His6은 인산화 영상화(D, 상단)에 의해 검출됩니다.야생형(wt) 단백질과 비교한 상대적인 활성은 D에 표시되며, 아래쪽은 세 번의 독립적인 실험의 평균(±SEM)으로 사용됩니다.별표는 보존되지 않은 잔기의 대체를 나타냅니다.(E) 감염 24시간 후 얻은 p1 세포의 배양 상등액의 바이러스 역가를 플라크 분석으로 결정했습니다.조작된 HCoV-229E 돌연변이의 NiRAN 도메인의 코돈 치환이 표시됩니다(잔기 번호 지정은 pp1ab에서의 위치를 ​​기준으로 함).복제 불능 RdRp 활성 부위 돌연변이 nsp12_DD4823/4AA를 대조군으로 사용했습니다.

NiRAN의 활성 부위에 대한 더 깊은 이해를 얻고 nsp9-특이적 NMP 트랜스퍼라제의 활성과 관련된 잔기를 결정하기 위해 우리는 돌연변이 분석을 수행하여 NiRAN AN, BN 및 CN 모티프의 보존적 잔기를 대체했습니다. 16) Ala이다(SI 부록, 그림 S2).또한 보수적인 Arg-to-Lys 또는 Lys-to-Arg 대체의 영향이 두 가지 경우에 평가되었습니다.(음성) 대조군으로서 코로나바이러스 및 기타 중첩 바이러스의 NiRAN 도메인에서 보존되지 않거나 덜 보존되는 잔기를 Ala로 대체합니다. K4116A(모티프 preAN에서), K4135A(AN), R4178A(BN), D4188A(모티프)를 교체합니다. BN) 및 D4280A(CN)는 nsp12를 통해 nsp9 NMPylation을 크게 줄이거나 심지어 제거하는 반면, 보존적 치환(R4178K), K4116R)이 있는 단백질은 활성의 60% 및 80%를 유지합니다. 이는 각각의 측면에 대한 제한이 완화되었음을 나타냅니다. 사슬은 물리화학적으로 민감합니다(그림 3D).여러 다른 보존된 잔기 E4145A, D4273A, F4281A 및 D4283A를 교체하는 것은 훨씬 덜 유해하며 nsp9 UMPylation은 적당히 감소합니다.다른 NTP(그림 3D 및 SI 부록, 그림 S3)와 관련된 nsp9 NMPylation 반응에서도 유사한 결과가 얻어졌으며, 이는 특정 아미노산 치환에 대해 관찰된 효과가 사용된 뉴클레오티드 공동 기질의 유형과 무관하다는 것을 확인시켜 줍니다.다음으로, 우리는 이러한 nsp12 치환이 세포 배양에서 코로나바이러스 복제에 미치는 영향을 테스트했습니다.이를 위해, 우리는 재조합 백시니아 바이러스(23, 24)에 클로닝된 적절한 유전자 조작 상보적 DNA(cDNA) 템플릿을 사용하여 5~7개의 세포를 전사했습니다.이들 세포에서 생성된 감염성 바이러스 자손의 적정은 대부분의 HCoV-229E NiRAN 돌연변이가 실현 가능하지 않음을 보여주었습니다(그림 3E).생존 불가능한 바이러스 돌연변이체 그룹에는 시험관 내에서 NMP 트랜스퍼라제 활성을 제거하거나 크게 감소시키는 것으로 밝혀진 대안이 포함되어 있지만(K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), 두 가지 다른 대안도 있습니다(K4116R, E4145A) 80 % 예약된?이들의 시험관 내 NMPylation 활동은 추가적인 제한이 포함되어 있음을 시사합니다.마찬가지로, NiRAN의 시험관 내 NMPylation 활성을 약간 감소시키는 두 가지 다른 돌연변이(R4178K, F4281A)는 살아있는 바이러스를 생성했지만 이러한 바이러스는 복제를 통해 역가를 크게 감소시켰습니다.그림 3D에 표시된 시험관 내 활성 데이터와 일치하여 코로나바이러스 및/또는 다른 중첩 바이러스(K4113A, D4180A, D4197A, D4273A)에서 보존되지 않은 4개의 다른 잔기를 대체하여(8, 16) 생존 가능한 바이러스를 생성했음에도 불구하고 자손 야생형 바이러스에 비해 역가가 적당히 감소했습니다(그림 3E).

NiRAN 매개 NMP 트랜스퍼라제 활성이 활성 RdRp 도메인에 의존하는지 여부를 연구하기 위해 RdRp 모티프 C에서 2가 금속 이온(11)의 배위와 관련된 두 개의 보존된 Asp 잔기를 Ala로 대체했습니다. 생성된 단백질 nsp12_DD4823/4AA는 nsp9 NMPylation 활성은 nsp12 매개 in vitro nsp9 NMPylation 활성이 중합효소 활성을 필요로 하지 않음을 나타냅니다(SI 부록, 그림 S4).

nsp12에 대한 nsp9 특이적 NMP 트랜스퍼라제 활성을 확립한 후, 우리는 질량 분석법(MS)을 통해 NMP-nsp9 부가물을 특성화하려고 했습니다.재조합 HCoV-229E nsp9의 전체 단백질 질량 스펙트럼은 12,045 Da에서 피크를 나타냈습니다(그림 4A).nsp12의 추가는 nsp9의 품질을 변경하지 않았으며, 이는 nsp12 및 nsp9가 사용된 조건(변성) 하에서 안정적인 복합체를 형성하지 않음을 나타냅니다(그림 4A).UTP와 GTP가 존재하는 경우, nsp9와 nsp12가 각각 포함된 반응의 질량 측정에서는 UTP의 단백질 질량이 306 Da 이동하고, GTP의 단백질 질량이 345 Da 이동한 것으로 나타나 각 nsp9 분자가 UMP 또는 GMP와 결합함을 나타냅니다. (그림 4) C와 D).NiRAN 매개 nsp9 NMPylation에 필요한 에너지는 NTP 가수분해 및 피로인산염 방출에서 비롯되는 것으로 추측됩니다.이 반응에서는 nsp12(효소)보다 10배 몰 과량의 nsp9(표적)이 사용되었지만 nsp9의 거의 완전한 NMPylation이 관찰되었으며 이는 nsp12와 nsp9 사이의 상호 작용이 수명이 짧고 nsp12가 더 많은 nsp9를 NMPylate할 수 있음을 나타냅니다. 시험관 내 분자.

nsp12 및 UTP 또는 GTP 존재 하에서 nsp9의 단일 NMPylation.HCoV-229E nsp9(SI 부록, 표 S1)(AD)의 분리된 완전 단백질 질량 스펙트럼이 표시됩니다.(A) nsp9 단독, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) UTP 존재 시 nsp9 + nsp12-His6, (D) GTP 존재 시 nsp9 + nsp12-His6.

nsp12에 의해 UMPylated nsp9 잔기를 확인하기 위해 nsp9-UMP를 트립신으로 절단했습니다.생성된 펩타이드를 나노 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리하고 온라인 탠덤 질량 분석법(MS/MS)으로 분석했습니다.Byonic 소프트웨어 패키지(Protein Metrics)를 사용한 데이터 분석은 N-말단 아미노산의 UMPylation을 보여주었습니다.이는 수동으로 확인됩니다.전구체 펩타이드 [UMP]NNEIMPGK(SI 부록, 그림 S5A)의 직렬 질량 스펙트럼은 421m/z에서 단편을 나타냈는데, 이는 UMP가 nsp9의 잔기 1에 결합함을 나타냅니다.

nsp9의 N 말단에서 Asn은 Orthocoronavirinae의 구성원들 사이에서 보존됩니다(SI 부록, 그림 S6).우리는 N 말단 1차 아민 질소가 UMP에 대한 가장 가능성 있는 수용체라고 믿지만 N 말단에서 NMP 결합에 대한 추가 증거를 얻기로 결정했습니다.이러한 이유로 HPLC로 정제된 NMPylated 및 NMPylated N 말단 펩타이드 nsp9는 아세톤 및 시아노보로하이드라이드 나트륨의 존재 하에서 파생되었습니다.이러한 조건에서는 유리 1차 아민만 프로필(25)로 변형될 수 있습니다.NNEIMPGK 서열을 갖는 N 말단 nsp9 유래 펩타이드는 2개의 1차 아민을 함유하고 있는데, 하나는 Asn의 N 말단에 있고 다른 하나는 C 말단의 Lys 측쇄에 있습니다.따라서 프로필 그룹이 양쪽 끝에 도입될 수 있습니다.NMPylated가 아닌 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램은 SI 부록, 그림 S5B에 나와 있습니다.예상한 대로 N-말단 및 C-말단(모노)프로필화(SI 부록, 그림 S5B, 위쪽 차선) 및 디프로필화 펩타이드(SI 부록, 그림 S5B, 아래쪽 차선)를 식별할 수 있습니다.이 패턴은 nsp9의 NMPylated N-말단 펩타이드를 사용하면 변경됩니다.이 경우 C-말단 프로필화 펩타이드만 확인이 가능하고, N-말단 프로필화 펩타이드와 디프로필화 펩타이드는 확인되지 않아(SI 부록, 도 S5C), 이는 UMP가 N-말단 1차 아민으로 옮겨진 것을 방지하기 위함이다. 그룹은 변경을 하지 않습니다.

다음으로, nsp9의 N 말단에 있는 보존된 잔기를 대체하거나(Ala 또는 Ser로) 삭제하여 표적 특정 제약 조건을 정의합니다.NiRAN이 nsp9의 N-말단 잔기의 1차 아민으로 nsp9-NMP 부가물을 형성한다는 것을 보여주는 MS 데이터를 기반으로, 우리는 nsp9 NMPylation이 nsp9 N-말단을 방출하기 위해 바이러스 마스터 프로테아제(Mpro, nsp5)가 필요하다는 가설을 세웠습니다. 다단백질 전구체.이 가설을 테스트하기 위해 우리는 대장균에서 nsp9를 포함하는 전구체 단백질 nsp7-11을 생산하고 [α-32P] UTP(재료 및 방법) 존재 하에서 표준 NMPylation 테스트를 수행했습니다.그림 5A(레인 3)에 표시된 대로 절단되지 않은 nsp7-11 전구체는 nsp12로 방사성 표지되지 않습니다.대조적으로, nsp7-11이 재조합 nsp5에 의해 절단되어 전구체로부터 nsp9(및 다른 nsps)를 방출하는 경우, nsp9와 함께 이동하는 방사성 표지 단백질이 검출되어 NiRAN 및 N-공유 nsp9-NMP 부가물이 선택적으로 형성된다는 결론이 확인됩니다. .N 말단 Asn의 말단 1차 아민(pp1a/pp1ab의 위치 3825).이 결론은 N-말단에 1개 또는 2개의 추가 잔기를 포함하는 nsp9 구조를 사용한 실험에서도 뒷받침됩니다.두 경우 모두, nsp9의 NiRAN 매개 UMPylation이 폐지되었습니다(SI 부록, 그림 S7).다음으로, 우리는 nsp9의 N-말단에 있는 3825-NNEIMPK-3832 펩타이드 서열에서 하나 또는 두 개의 Asn 잔기가 결실된 단백질을 생산했습니다.두 경우 모두 nsp9 UMPylation이 완전히 차단되어(그림 5B) 실제 nsp9 N-말단이 NMP 수용체 역할을 한다는 추가적인 증거를 제공합니다.

nsp9의 단백질 분해 과정과 nsp12 매개 UMPylation에서 N 말단 잔기의 역할.(A) nsp9 UMPylation에는 무료 nsp9 N-말단이 필요합니다.Nsp7-11-His6은 재조합 Mpro(nsp5-His6)의 존재 또는 부재 하에 UTP를 함유하는 NMPylation 검출 완충액에서 30°C에서 사전 배양됩니다.3시간 후 재료 및 방법에 설명된 대로 nsp12-His6을 추가하여 NMPylation 분석을 시작합니다.nsp5-His6(레인 1) 및 nsp9-His6(레인 2)을 포함하는 반응을 대조군으로 사용했습니다.10분 후 반응을 종료하고 반응 혼합물을 SDS-PAGE로 분리하였다.단백질은 Coomassie Brilliant Blue(A, 상단)로 염색되었습니다.Nsp7-11-His6 전구체와 nsp5-His6 매개 절단으로 인한 가공된 생성물이 오른쪽에 표시되어 있습니다.nsp7 및 nsp11-His6은 작은 크기로 인해 이 젤에서 검출되지 않으며 반응은 nsp5-His6으로 보충됩니다(레인 1 및 4, nsp5-His6의 위치는 실선으로 표시됨). 또는 nsp9-His6(레인 2)은 MBP 융합 단백질(SI 부록, 표 S1)로 표현되기 때문에 잔류 불순물로 소량의 MBP(흰색 원으로 표시)를 포함합니다.(B) Nsp9-His6 변이체에는 1개 또는 2개의 N 말단 Asn 잔기(pp1a/pp1ab의 위치에 따른 잔기 번호 지정)가 부족하고 정제되어 nsp12-His6 및 [α-32P] UTP와 함께 배양됩니다.B, Coomassie로 염색된 SDS-PAGE는 상단에 표시되고, B에는 해당 자동 방사선 사진이 하단에 표시됩니다.분자량 마커의 위치(킬로달톤 단위)는 왼쪽에 표시됩니다.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N 말단 보존 잔기를 Ala 또는 Ser로 대체하고, nsp12-His6 매개 UMPylation 반응에 동일한 양의 단백질을 사용했습니다.반응 생성물을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루(C, 상단)로 염색하고, 방사성 표지된 nsp9-His6을 인광 이미징(C, 중간)으로 검출했습니다.야생형(wt) 단백질을 기준으로 사용하여(100%로 설정) 상대 NMPylation 활성(평균 ± SEM)을 3개의 독립적인 실험을 통해 계산했습니다.(D) HCoV-229E 야생형 Huh-7 세포로 감염된 Huh-7 세포의 p1 세포 배양 상청액 및 nsp9에서 지정된 아미노산 치환을 운반하는 돌연변이체의 바이러스 역가를 플라크 분석에 의해 결정하였다.복제 불능 RdRp 모티프 C 이중 돌연변이 DD4823/4AA를 음성 대조군으로 사용했습니다.

nsp9의 N 말단(특히 위치 1, 2, 3 및 6)은 Orthocoronavirinae 하위 계열의 구성원 사이에서 매우 보존되어 있습니다(SI 부록, 그림 S6).nsp12 매개 nsp9 NMPylation에서 이러한 잔기의 가능한 역할을 연구하기 위해 nsp9의 N 말단에 있는 두 개의 연속 Asn 잔기를 Ala 또는 Ser(단독 또는 조합)로 대체했습니다.야생형 nsp9와 비교하여 N3825를 Ala 또는 Ser로 대체하면 nsp12 매개 UMPylation이 2배 이상 감소했습니다(그림 5C).N-말단 잔기의 측쇄 대신 N-말단 1차 아민에서 NMPylation이 발생한다는 결론과 일치하여, 우리는 N3825A 및 N3825S를 대체하여 중요한 잔류 NMPylation을 관찰했습니다.흥미롭게도 두 번째 Asn이 Ala 또는 Ser로 대체되면 nsp9 UMPylation은 더 강하게(10배 이상) 감소하는 반면, 위치 3, 4 및 6에서 Ala를 대체하면 nsp9 UMPylation에 중간 정도의 영향만 미칩니다(그림 2). ) .5C).ATP, CTP 또는 GTP를 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다(SI 부록, 그림 S8).종합적으로, 이러한 데이터는 nsp9 NMPylation에서 N2826(nsp9의 위치 2)의 핵심 역할을 나타냅니다.

nsp9의 N-말단과 NMPylation 사이의 기능적 상관관계에 대한 추가 증거를 얻기 위해 우리는 코로나바이러스 계열의 nsp9 서열(104~113개 잔기 사이에서 다양함)의 다중 서열 정렬(MSA)을 수행했습니다(SI 부록, 그림 S6).전체적으로, 서로 다른 포유류, 조류 및 파충류 숙주를 감염시키는 Orthocoronavirinae 아과의 5개 속, 47개(알려진 추정) 종에서 총 8개의 잔기만이 불변인 것으로 밝혀졌습니다.삭제 및 삽입을 포함한 가장 광범위한 변화는 이전 구조 연구(26~28)에 의해 결정된 바와 같이 nsp9의 2차 구조 요소 사이의 주기에서 관찰되었습니다.nsp9의 C-말단 부분의 β 가닥과 α 나선에서 5개의 불변 잔기가 발견되었습니다.3개의 불변 잔기가 nsp9의 N 말단의 NNE 모티프를 구성합니다.이 모티프의 두 번째 Asn은 먼 관련이 있는 개구리 코로나바이러스의 가상 nsp9에 의해 공유되는 유일한 불변 잔기이며 Alphaletovirus의 Letovirinae 아과에 있는 Microhyla letovirus 1 종을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다.nsp9 2차 구조 요소의 잔기 보존은 접힘 또는 알려진 RNA 결합 특성을 유지하기 위한 구조적 고려 사항에 의해 합리화될 수 있습니다.그러나 이러한 추론은 NNE의 보존에는 적용되지 않는 것으로 보이며, 이 연구 이전에는 트리펩타이드 서열의 변화를 제한하는 제약의 성격이 완전히 모호했습니다.

코로나바이러스 복제에서 nsp9-NMPylation 및 NNE 보존의 중요성을 확인하기 위해 우리는 nsp9 N-말단 잔기의 단일 또는 이중 치환을 수행하는 HCoV-229E 돌연변이를 생성했는데, 이는 nsp9 NMPylation이 시험관 내에서 해롭다는 것을 나타냅니다.시작하기 전에 이러한 치환(nsp8|9 절단 부위 근처)이 C 말단 pp1a 영역의 단백질 분해 처리에 영향을 미치는지 여부에 대한 질문에 대답하려고 합니다.nsp9의 N-말단에 상응하는 치환을 함유하는 nsp7-11 다중단백질 구축물 세트를 E. coli에서 생산하고 재조합 Mpro로 절단했습니다.4개 부위(nsp9 측면 부위 포함)의 단백질 분해 절단은 Mpro 매개 nsp8|9 절단을 방해하는 이들 단백질의 구조적 변화를 제외하고 도입된 치환(SI 부록, 도 S9)에 의해 크게 영향을 받지 않습니다(또는 기타). 웹사이트.

Huh-7 세포는 nsp9 N 말단에서 보존된 NNE 트리펩타이드(N3825, N3826 및 E3827)의 Ala 또는 Ser 치환을 코딩하는 게놈 길이의 HCoV-229E RNA로 형질감염되었으며, 이는 대부분의 돌연변이가 치명적이라는 것을 보여줍니다.N 말단 Asn의 Ser 또는 Ala(N2835A 또는 N2835S)를 교체하여 바이러스를 구출할 수 있었지만, NNE 서열(N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A)(그림 5D).

이러한 결과는 조직 배양에서 코로나바이러스의 복제가 제한되어(동일하거나 유사) 신체 내 nsp9 NMPylation 부위의 자연 돌연변이를 제한하고 코로나바이러스의 수명 주기에서 이러한 반응의 핵심 역할을 뒷받침한다는 것을 나타냅니다.

마지막 실험 세트에서 우리는 대장균에서 SARS-CoV-2 nsp12 및 nsp9로 표지된 C 말단 His6과 두 가지 돌연변이 형태의 nsp12를 생산했습니다.NiRAN 및 RdRp 도메인의 활성 사이트 잔기는 각각 Ala를 대신 사용했습니다(그림 6A 및 SI 부록, 표 S2).SARS-CoV-2 nsp12의 K4465는 NiRAN 활동 및 HCoV-229E 복제에 필요한 것으로 입증된 HCoV-229E(SI 부록, 그림 S2)의 K4135에 해당합니다(그림 3D 및 E).이 잔기는 또한 이전에 NiRAN 자가 UMPylation/자가 GMPylation에 필요한 것으로 밝혀진 동맥 바이러스 EAV nsp9 K94 잔기에 해당합니다(16).그림 6B에 표시된 것처럼 SARS-CoV-2 nsp12는 nsp9를 기질로 사용하여 UMP 트랜스퍼라제 활성을 갖는 반면, nsp12_K4465A 활성 부위 돌연변이는 비활성입니다.RdRp 모티프 C의 SDD 특성 서열의 이중 치환은 UMP 트랜스퍼라제 활성에 영향을 미치지 않으며(그림 6B), 이는 RdRp 활성이 nsp9 UMPylation에 직접적인 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.CTP, GTP 및 ATP를 사용하여 유사한 데이터를 얻었습니다(SI 부록, 그림 S10).요약하면, 이러한 데이터는 NiRAN 매개 nsp9 NMPylation이 오르토코로나바이러스 아과의 다양한 속을 나타내는 코로나바이러스에서 보존적 활성을 가지고 있음을 나타냅니다.

SARS-CoV-2 nsp9의 nsp12 매개 NMPylation.(A) NMPylation 테스트에 사용된 재조합 단백질을 보여주는 쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔.대조군으로는 SARS-CoV-2 nsp12의 NiRAN 도메인(K4465A)과 RdRp 도메인(DD5152/3AA)에 활성 부위 치환이 있는 돌연변이 단백질을 사용했습니다.잔류물 번호 지정은 pp1ab의 위치를 ​​기준으로 합니다.(B) nsp12-His6(야생형 [wt] 및 돌연변이)의 기질로 nsp9-His6 및 [α-32P]UTP를 사용한 UMPylation 검출의 자동방사선 사진.표지된 단백질의 분자 질량(킬로달톤 단위)은 왼쪽에 표시됩니다.

NiRAN 도메인은 일반적으로 Nidovirales에서 보존되며(16), 이는 Nidovirus 복제에 필수적인 효소 반응을 촉매한다는 것을 나타냅니다.이번 연구에서는 코로나바이러스의 NiRAN 도메인이 NTP(NTP에서 생성)를 바이러스 복제에 관여하는 신비한 RNA 결합 단백질인 nsp9(26 ?? 29 )로 전달하여 이를 천연 표적으로 삼고 있음을 증명할 수 있었고, 코로나바이러스 RTC의 파트너.

NiRAN 도메인은 단계통이지만 고도로 분화된 Nidovirales 목의 모든 과에서 보존되는 매우 적은 수의 잔기를 포함하는 세 가지 서열 모티프(AN, BN 및 CN)를 공유합니다(8, 16).최근 연구에 따르면 이들은 원래 SelO 계열이라고 불렸던 거의 특징이 없는 단백질 키나제 유사 단백질 계열과 구조적으로 관련이 있는 것으로 나타났습니다(17, 19, 22, 30, 31).SelO 관련 단백질에는 키나아제 접힘이 있지만 고전적인 키나아제에는 보존된 여러 활성 부위 잔기가 부족합니다(22, 32).활성 부위에 결합되고 특정 상호작용에 의해 안정화되는 ATP 분자의 역방향에 기초하여, SelO는 가설을 세웠고 이후에 AMP(인산염 대신)를 단백질 기질로 전달하는 것으로 확인되었으며(22), 또 다른 박테리아 SelO 유사 단백질 YdiU는 최근에는 다양한 단백질 기질의 Tyr 및 His 잔기에 UMP가 공유결합으로 부착되는 것을 촉매하는 것으로 나타났습니다(33).

코로나바이러스 NiRAN 도메인의 추정 활성 부위 잔기에 대한 예측을 확인하고 확장하기 위해 우리는 생화학적 및 역유전학 방법을 사용하여 코로나바이러스 nsp12에 대한 돌연변이 분석을 수행했습니다(그림 3D 및 E 및 SI 부록, 그림 S3 및 표) S1' S4).데이터는 HCoV-229E K4135, R4178 및 D4280을 Ala로 대체하면 세포 배양에서 시험관 내 NMP 트랜스퍼라제 활성 및 바이러스 복제를 제거하여(그림 3D 및 E 및 SI 부록, 그림 S3) NTP γ-인산염에서의 존재를 뒷받침한다는 것을 보여줍니다. ( K4135, R4178) 및 활성 부위 금속 이온의 배위 (D4280).K4135(17) 위치를 안정화시키는 것으로 예측된 ​​새둥지 바이러스 범위에서 보존된 Glu의 E4145A 대체는 바이러스 복제를 제거하는 것으로 나타났지만 놀랍게도 활성은 시험관 내 NMPylation 분석에서 유지되었습니다(그림 3D 및 E 및 E). SI 부록, 그림 S3 및 표 S1–S4).상응하는 치환이 Salmonella typhimurium(E130A)의 YdiU 동족체에 도입되었을 때 유사한 관찰이 이루어졌습니다(33).종합하면, 이들 데이터는 촉매 기능보다는 보존된 잔류물의 조절 기능을 뒷받침합니다.

HCoV-229E NiRAN 도메인(8)의 네스토바이러스 범위 내에서 보존된 Phe 잔기(F4281A)를 교체하면 시험관 내에서 NMPylation 활성이 감소하고 세포 배양에서 바이러스 복제가 크게 감소했습니다(그림 3D, E 및 SI). 부록, 그림 S3).데이터는 이전에 표시된 상동 DFG 모티프 Phe 잔기와 같은 이 잔기의 중요한 조절 기능과 일치합니다.고전적인 단백질 키나아제에서는 Mg2+ 결합 루프의 일부이며 척추를 조립하고 조절하는 데 도움이 됩니다.??효과적인 촉매 활동에 필요합니다(32, 34).K4116 잔기(preAN 모티프에서)를 각각 Ala 및 Arg로 대체하면 바이러스 복제가 제거되었으며 예상한 대로 도입된 아미노산 측쇄에 따라 시험관 내 NMP 트랜스퍼라제 활성에 다른 효과가 있었습니다(그림 3D 및 E 및 SI 부록). , 그림 S3).기능적 데이터는 구조적 정보와 일치하며, 이는 이 잔기가 ATP 인산염과 상호작용을 확립했음을 나타냅니다(17).다른 중첩된 바이러스 계열의 NiRAN 도메인에서 HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116의 위치는 Lys, Arg 또는 His(8)가 차지하는데, 이는 이 특정 잔기의 기능적 제한이 완화되었음을 나타냅니다.D4188A 및 D4283A의 대체는 효소 활성을 제거하거나 크게 감소시키고 바이러스 복제를 제거합니다(그림 3).이 두 잔기는 대부분의(전부는 아님) 중첩 바이러스에서 보존되며(8), 이는 중요한 가족별이지만 아마도 비촉매적 기능을 나타냅니다.Coronaviridae 또는 다른 Nestioviridae 계열(8)에서 보존되지 않는 여러 다른 Lys 및 Asp 잔기(K4113A, D4180A, D4197A 및 D4273A)의 Ala 치환을 대조군으로 사용했습니다.예상한 대로 이러한 치환은 대체로 허용 가능하며 경우에 따라 효소 활성 및 바이러스 복제가 약간 감소합니다(그림 3 및 SI 부록, 그림 S3).전반적으로, 코로나바이러스 돌연변이 유발 데이터는 EAV NiRAN-RdRp(16)의 자가-GMP 및 역유전학 데이터와 매우 일치하며, 여기서 EAV nsp9(코로나바이러스 nsp12 오솔로그) ​​잔기 K94(HCoV-229E K4135에 해당) 중요한 기능), R124(R4178에 해당), D132(D4188에 해당), D165(D4280에 해당), F166(F4281에 해당).또한, HCoV-229E 돌연변이 유발 데이터는 이전에 보고된 SARS-CoV 역유전학 데이터(16)와 일치하고 확장되었으며, 이는 해당 CN 모티프 Phe-to-Ala 돌연변이 SARS-CoV_nsp12에 대해 관찰된 것과 매우 유사합니다. 표현형은 -F219A 및 HCoV-229E_F4281A를 설명합니다(그림 3 D 및 E 및 SI 부록, 그림 S3 및 표 S1-S4).

UTP 및 GTP(자가 NMPylation 반응에서)를 분명히 선호하는 EAV 오솔로그(16)와 비교하여, 우리 연구에서는 코로나바이러스 NiRAN 도메인(HCoV-229E 및 SARS-CoV-2로 표시)이 효과적으로 UMP를 약간 선호하지만(그림 1 및 3) 4개의 NMP를 모두 전송했습니다.특정 NTP 공동 기판의 상대적으로 낮은 특이성은 최근 보고된 SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 슈퍼복합체 구조와 일치합니다. 여기서 ADP-Mg2+는 NiRAN의 활성 부위에 결합하지만 아데닌과는 결합하지 않습니다. 특정 상호 작용의 형성 (17).우리 연구에서 NMPylation 반응에 사용된 뉴클레오티드 유형은 돌연변이 단백질의 활성에 차별적인 영향을 미치지 않으며(SI 부록, 그림 S3), 이러한 잔기 중 어느 것도 특정 핵염기의 결합과 밀접하게 관련되어 있지 않음을 나타냅니다.코로나바이러스와 동맥 바이러스의 NiRAN 도메인에서 관찰된 다양한 NTP 공동 기질 선호도의 구조적 기초와 잠재적인 생물학적 중요성은 아직 연구 대상으로 남아 있습니다.그것은 사실일 수도 있고, 각각의 연구의 한계 때문일 수도 있습니다.현재 동맥 바이러스 NiRAN 도메인의 잠재적인 NMPylator 활성(이전에 특징화된 자가 NMPylation 활성과 비교하여)이 동맥과 코로나바이러스 간의 유사성을 고려하여 서로 다른 공동 기질 선호도를 갖는다는 점을 배제할 수 없습니다. NiRAN 도메인이 한계에 도달했습니다.시퀀스 기반 비교(16).Mg2+를 보조 인자로 사용하는 슈도키나제 SelO와 비교하여 코로나바이러스와 동맥 바이러스 NiRAN의 활성은 Mn2+에 의존합니다(16)(그림 3C 및 SI 부록, 그림 S1).Mn2+ 의존성과 UTP에 대한 명백한 선호는 단백질 NMPylator의 특이한 특징이며, 스트레스 유도로부터 세포를 보호하기 위해 엄격한 Mn2+ 의존성 단백질 샤페론 UMPylation을 촉매하는 Salmonella typhimurium의 YdiU 단백질에서 최근에야 확인되었습니다. 33).

최근에 설명된 코로나바이러스 NiRAN 도메인과 세포 단백질 키나제(17, 19) 사이의 구조적 유사성은 NMP를 이 연구에서 보고된 다른 단백질에 공유 결합시키는 NiRAN의 능력에 대한 추가 지원을 제공합니다.우리는 RTC의 ORF1b 인코딩 복제효소를 직간접적으로 지원하는 것으로 알려진 HCoV-229E ORF1a에 의해 인코딩된 단백질에 대한 가능한 NiRAN 표적 검색에 중점을 두었습니다(12, 35).우리의 실험은 nsp9의 효과적이고 구체적인 NMPylation에 대한 결정적인 증거를 제공합니다(그림 2).목적 단백질을 효소(nsp12)보다 8~10배 몰 과량으로 사용하면 nsp9가 완전히 (모노)NMP화되어 있음을 확인할 수 있다(그림 4).우리는 nsp12와 nsp9 사이의 상호 작용이 수명이 짧고 (다른 RTC 하위 단위가 없는 경우) nsp9와 안정적인 복합체를 형성하지 않을 것이라고 결론지었습니다.이 결론은 SARS-CoV 프로테옴에 대한 단백질 상호작용 연구에 의해 뒷받침됩니다(35).MS 분석은 nsp9의 N-말단 잔기의 1차 아민을 NMPylation 부위로 식별했습니다(SI 부록, 그림 S5).포스포라미데이트 결합과 N-말단 아미노 그룹의 형성은 NiRAN 매개 NMPylation 활성을 Ser, Thr 또는 Tyr 잔기에서 O-연결 AMP 형성을 촉매하는 Pseudomonas syringae SelO 매개 AMPylation 반응과 구별합니다. 펩티드 부가물( 22), S. typhimurium YdiU는 O-연결(Tyr과) 및 N-연결(His와) 펩타이드-UMP 부가물을 형성합니다.SelO 단백질 계열에 대해 이용 가능한 제한된 정보는 이 큰 단백질 계열의 구성원이 펩타이드-NMP 부가물의 형성에 있어 크게 다르다는 것을 나타냅니다.이는 더 많은 연구를 할 가치가 있는 흥미로운 관찰입니다.

이 연구에서 얻은 데이터는 nsp9의 NMPylation에 자유 N 말단이 필요하다는 가설을 세웠습니다.바이러스 복제의 맥락에서 이는 Mpro 및 pp1ab에 의해 매개되는 복제효소 다단백질 pp1a의 nsp8|nsp9 처리 부위의 단백질 분해 절단에 의해 제공됩니다.대부분의 코로나바이러스에서 이 특정 부위(HCoV-229E의 VKLQ|NNEI)와 다른 모든 코로나바이러스 Mpro 절단 부위의 차이점은 Asn(Ala, Ser 또는 Gly와 같은 다른 작은 잔류물이 아님)이 P1â를 점유한다는 점입니다.??위치 (36).초기 연구에서 얻은 펩타이드 절단 데이터는 nsp8|nsp9 부위의 절단 효율이 다른 부위의 절단 효율보다 낮음을 보여 주었으며, 이는 1) 이 특정 부위가 C-말단의 적시에 조정된 처리에서 조절 역할을 할 수 있음을 나타냅니다. pp1a 영역 또는 2) a 바이러스 복제에서 특수하게 보존된 nsp9 N-말단의 역할(37).우리의 데이터(그림 5A)는 실제 N-말단 서열을 운반하는 재조합 형태의 nsp9가 nsp12에 의해 효과적으로 NMP화되었음을 보여주었습니다.N-말단 측면 서열은 인자 Xa(nsp9-His6; SI 부록, 표 S1) 또는 Mpro 매개 절단(nsp7-11-His6; 그림 5A 및 SI 부록, 표 S1)에 의해 제거되었습니다.중요하게도, 절단되지 않은 nsp9 함유 전구체 nsp7-11-His6은 nsp12의 NMPylation에 대한 저항성을 보였으며 이는 우리의 데이터와 일치하며 nsp9-NMP 부가물이 N 말단 1차 아민을 통해 형성됨을 나타냅니다(SI 부록, 그림 S5). .NiRAN 기질 특이성에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 우리는 nsp9의 인접한 N 말단 잔기에 중점을 두었습니다.다른 단백질이 없으면 구조적으로 유연하여 nsp9의 표지되지 않은 형태에서 검출되는 것을 방지합니다(26 28, 38). 이는 제한된 자연적 변이를 나타냅니다. 이는 중요한 서열 특이적(2차 구조와 관련 없음) 때문입니다. nsp9 N-말단 단편의 기능.이 영역에서 보존된 잔기의 Ala 치환(그림 5C 및 D 및 SI 부록, 그림 S8)은 N3826이 시험관 내에서 nsp9 NMPylation에 필수적인 반면 N3825A 및 E3827A 치환은 NMPylation의 감소로 이어지는 반면 M3829A 및 P3830A 치환은 그렇지 않음을 보여줍니다. .분명히 nsp9 NMPylation에 영향을 미칩니다.N-말단 Asn(N3825A, N3825S)의 치환은 세포 배양에서 nsp9 NMPylation 및 바이러스 복제에 중간 정도의 효과만을 가지지만(그림 5C 및 D), N-말단 3825-NN 디펩티드에서 Asn 잔기 서열의 삭제 유사한 잔기의 치환이 부분적으로 허용될 수 있는 것처럼 보이지만 N-말단의 다른 잔기(바람직하게는 Asn) 전에 하나의 Asn 잔기가 필요하다는 것을 나타내는 바이러스에 치명적이라는 것이 입증되었습니다(그림 5B, C 및 D).우리는 3825-NN 디펩티드, 특히 코로나바이러스 범위(SI 부록, 그림 S6) 내의 보존되고 필수적인 N3826 잔기가 NiRAN의 활성 부위에서 nsp9 N 말단의 올바른 결합과 방향을 보장한다고 결론을 내렸습니다.

모든 하위 계열의 보존된 Glu를 Ala(E3827A)로 대체하면 시험관 내에서 nsp9 NMPylation이 유지되지만 세포 배양에서 바이러스에 치명적입니다(그림 5C 및 D). 이는 예를 들어 주요 상호 작용(NMPylated 또는 수정되지 않은)에서 이 잔기의 추가 기능을 나타냅니다. ) nsp9 N-말단 및 바이러스 복제와 관련된 기타 요인.Nsp9 돌연변이는 nsp9 또는 인접한 nsps의 단백질 분해 과정에 영향을 미치지 않았으며(39)(SI 부록, 그림 S9), 이는 관찰된 여러 nsp9 돌연변이의 치명적인 표현형이 C 단백질 분해 과정 말단 pp1a 영역의 조절 장애로 인해 발생하지 않았음을 나타냅니다. .

위 데이터는 pp1a/pp1ab의 nsp8|9 절단 부위에 대한 Mpro 매개 처리 후 nsp9의 N 말단이 UMPy화될 수 있다는(또는 다른 NMP로 부분적으로 변형될 수 있음) 증거를 제공합니다.또한, nsp9의 N-말단(코로나바이러스 계열의 단일 및 불변 Asn 잔기 포함)의 탁월한 보존과 이 연구에서 얻은 역유전학 데이터(그림 3E 및 5D)를 통해 설명된 nsp9 NMPylation이 생물학적으로 관련되어 있으며 코로나바이러스 복제에 필수적입니다.이러한 변형의 기능적 결과는 예를 들어 이전에 설명된(비특이적) nsp9(변형되지 않은 형태) RNA 결합 활성과 관련하여 계속 연구되어야 합니다(2628).N-말단 NMPylation은 또한 nsp9와 단백질 또는 RNA 기질의 상호 작용 또는 서로 다른 4단계 어셈블리의 형성에 영향을 미칠 수 있습니다.이는 구조 연구에서 관찰되었으며 특히 이러한 변형이 없는 경우에도 코로나바이러스 복제와 기능적으로 관련이 있는 것으로 확인되었습니다(26--29, 40).

코로나바이러스 NiRAN 도메인의 표적 특이성은 여전히 ​​더 자세히 특성화되어야 하지만, 우리 데이터에 따르면 코로나바이러스 NiRAN 도메인의 단백질 표적 특이성은 매우 좁습니다.모든 니도바이러스 계열의 NiRAN 도메인에 있는 주요 활성 부위 잔기(8, 16)의 보존이 이러한 단백질의 보존된 NMPylator의 활성을 강력하게 뒷받침하지만, 이 도메인의 기질 결합 포켓 잔기의 동일성은 여전히 ​​특성화되어야 합니다. , Nidovirales 목적의 계열에 따라 다를 수 있습니다.마찬가지로, 다른 중첩 바이러스의 관련 표적도 아직 결정되지 않았습니다.Mpro와 NiRAN 사이의 게놈 배열을 포함하여 중첩된 바이러스에 일반적으로 보존되는 5개의 복제효소 도메인 외부 서열은 덜 보존되기 때문에 그들은 nsp9 또는 다른 단백질의 원격 오솔로그일 수 있으며, 그중 nsp9는 코로나 바이러스.

또한 현재 NiRAN 도메인에 추가(셀룰러 포함) 대상이 있을 가능성을 배제할 수 없습니다.이 경우, 이 새로운 단백질 NMPylator(NMPylator)(30, 31)의 박테리아 동족체에 "마스터 조절자"가 있는 것 같다는 점을 언급할 가치가 있습니다.NMP는 다양한 세포 단백질을 조절하여 그 하류 활동을 조절하거나 제거함으로써 세포 스트레스 반응 및 산화환원 항상성과 같은 다양한 생물학적 과정에서 역할을 합니다(22, 33).

이 연구(그림 2 및 4 및 SI 부록, 그림 S3 및 S5)에서 우리는 nsp12가 UMP(NMP) 부분을 nsp9의 단일(보존된) 위치로 이동시키는 반면 다른 단백질은 변형되지 않았음을 증명할 수 있었습니다. 사용되는 조건에서는 잘 정의된(느슨하지 않고) 기질 특이성이 지원됩니다.이에 따라 N-말단 nsp9 NMPylation과 비교하여 nsp12 자체의 NMPylation 활성은 매우 낮으며 이를 검출하려면 더 긴 자가방사선 촬영 노출 시간이 필요하며 nsp12 농도의 10배 증가가 사용됩니다.또한, 우리의 MS 분석은 nsp12의 NMPylation에 대한 증거를 제공하지 못했습니다. 이는 NiRAN 도메인 자체 NMPylation이 (기껏해야) 2차 활동임을 시사합니다.그러나 다른 연구에서는 박테리아 NMPylator의 자가 AMPylation 상태가 다른 단백질 기질에 대한 NMPylation 활성을 제어할 수 있다는 예비 증거를 제공했다는 점에 유의해야 합니다(22, 33).따라서 C 말단 RdRp 도메인의 접힘에 대해 제안된 샤페론 유사 효과를 포함하여 EAV nsp9(16) 및 코로나바이러스 nsp12(본 연구)에 대해 보고된 자가 NMPylation 활성의 가능한 기능적 효과를 조사하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 16) ).

이전에는 RNA 리가제, RNA 캡핑된 구아닐레이트 트랜스퍼라제 및 단백질 프라이밍 활성을 포함하여 니도바이러스 NiRAN 도메인의 가능한 하류 기능에 관한 몇 가지 가설이 고려되었지만(16) 이들 중 어느 것도 사용 가능한 하류 기능과 호환되지 않습니다.다음 위치에서 얻은 정보는 추가적인 가정 없이 정확히 동일한 시간입니다.이 연구에서 얻은 데이터는 NiRAN 도메인이 단백질 유도 RNA 합성의 시작에 관여한다는 사실과 가장 일치합니다(증명할 수는 없음).이전에는 NiRAN 도메인의 기능이 5??²-RNA capping 또는 RNA ligation 반응은 이들 및 기타 데이터의 지원에 의해 영향을 받지 않습니다.따라서 예를 들어 NiRAN의 활성 사이트는 보존된 Asp를 일반 염기(Pseudomonas syringae SelO의 D252, HCoV-229E pp1ab의 D4271, SARS-CoV-2 nsp12의 D208)로 포함하는 것으로 간주됩니다(SI 부록, 그림 2 ).S2)(17, 22, 33), ATP 의존성 RNA 리가제 및 RNA 캡핑 효소의 촉매작용은 공유결합 효소-(lysyl-N)-NMP 중간체에 의해 수행되는 반면, 이는 변경되지 않은 Lys 잔기를 포함합니다( 41).또한, 보존된 단백질 표적에 대한 코로나바이러스 NiRAN의 놀라운 서열 기반 특이성과 NTP 보조 기질(UTP 선호)에 대한 완화된 특이성은 NiRAN 매개 캡핑 효소 또는 RNA 리가제 유사 기능에 반대됩니다.

분명히, 단백질 유도 RNA 합성에서 nsp9-UMP(nsp9-NMP)의 가능한 역할을 확인하고 입증하려면 많은 추가 작업이 필요하며, 이는 이전에 보고된 몇 가지 흥미롭지만 (지금까지) 보고된 내용과 연결될 것입니다. .고립된 관찰.예를 들어, 코로나바이러스의 음성 가닥 RNA의 끝은 올리고(U) 가닥으로 시작하는 것으로 확인되었습니다(42, 43).이러한 관찰은 음성 가닥 RNA의 합성이 nsp9의 UMPylated 형태를 폴리(A) 꼬리에 결합함으로써 시작된다는 생각과 일치하며(촉발), 이는 RNA 결합에 의해 촉진될 수 있습니다. 또 다른 RTC 단백질.nsp9에 의해 제공되는 UMP 부분은 게놈 RNA의 3??²-폴리(A) 꼬리 또는 다른 올리고(A) 함유 서열을 사용하여 nsp7/8/nsp12 매개 올리고우리딜화를 위한 "프라이머"로 사용될 수 있습니다. picornavirus VPg 단백질에 대해 확립된 메커니즘과 유사한 주형 역할을 합니다(44).제안이 "비규범적"이라면 어떻게 되나요????(단백질 유도) 음성 가닥 RNA 합성의 시작은 관찰 결과에 대한 연결을 제공하며, 이는 코로나바이러스 음성 가닥 RNA의 끝 부분에 UMP(UTP 대신)가 있음을 나타냅니다(42). 핵산 Dicer는 알려지지 않은 유리딘 특이적 엔도뉴클레아제에 의해 인산화된 말단을 절단합니다.확인되면, 이 핵산 가수분해 활성은 초기 음성 가닥의 5² 끝에서 nsp9의 올리고머 UMPylated 형태를 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다.단백질 프라이밍에서 nsp9의 가능한 역할은 nsp9(및 nsp8)가 코로나바이러스 게놈의 3번째 말단 근처에 보존된 cis-acting RNA 요소와 비판적으로 그리고 구체적으로 상호 작용한다는 것을 보여준 이전 역유전학 연구와도 일치합니다.45).이 보고서에 따르면, 이러한 이전 관찰은 이제 추가 연구를 통해 재검토되고 확장될 수 있습니다.

요약하면, 우리의 데이터는 N 말단의 RdRp에 연결된 독점 중첩 바이러스 효소 태그의 특정 활성을 결정했습니다.코로나바이러스에서 새로 발견된 이 NiRAN 매개 UMPylator/NMPylator 활동은 Mn2+ 및 인접한 Asn 잔기에 의존하고 N 말단 1차 아민과 (저에너지) 포스포라미데이트 결합을 형성하는 데 사용됩니다.nsp8|9 절단 부위에서 Mpro 매개 절단을 통해 nsp9 표적은 NMPylation에 사용될 수 있으며, 이는 프로테아제와 RdRp까지 확장되는 NiRAN 도메인 사이의 기능적 결합을 나타냅니다.SARS-CoV-2를 포함한 두 코로나바이러스에서 얻은 데이터와 결합된 nsp12 NiRAN 활성 사이트와 nsp9 표적의 주요 잔류물의 보존은 nsp9 NMPylation이 코로나바이러스라는 강력한 증거를 제공합니다. 보수적 특징도 바이러스 복제의 핵심 단계입니다.이용 가능한 데이터를 통해 우리는 단백질 유도 RNA 합성에서 NMPylated 형태의 nsp9의 특정 역할이 코로나바이러스 및 기타 중첩 바이러스에 대한 합리적인 시나리오이며 NiRAN은 다른 미확인 단백질을 표적으로 삼을 수도 있다는 결론을 내릴 수 있습니다.바이러스를 조절하세요.호스트 상호 작용.확인된다면, 바이러스 RNA 합성에 단백질 프라이머가 관여하는 것은 이전에 발견된 코로나바이러스와 피코르나바이러스 유사 슈퍼그룹(9) 사이의 Mpro/3CLpro 및 RdRp 도메인의 서열 친화성을 증가시킬 것이며, 이는 최근 확립된 Pisonivirites로 통합되었습니다(9). 46) 카테고리에 있다.

우리의 데이터는 또한 이 연구에서 확인된 기본, 선택 및 보존 효소 활성이 항바이러스 약물의 표적으로 사용될 수 있음을 보여줍니다.NiRAN의 활성 부위에서 보존된 nsp9 N-말단의 결합(및 후속 변형)을 방해하는 화합물은 효과적이고 다양한 항바이러스 약물로 개발될 수 있으며, 이는 다양한 (아)속 감염의 동물 및 인간 코로나바이러스 치료에 적합합니다. SARS-CoV-2 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스를 포함합니다.

본 연구에서 생산된 코로나바이러스 단백질의 코딩 서열은 HCoV-229E에 감염된 Huh-7 또는 SARS-CoV-2에 감염된 Vero E6에서 분리한 RNA를 사용하여 RT-PCR로 증폭하고 표준 클로닝 절차를 사용하여 삽입했습니다.pMAL-c2(New England Biological Laboratory) 또는 pASK3-Ub-CHis6(47) 발현 벡터(SI 부록, 표 S1 및 S2).단일 코돈 치환은 PCR 기반 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 도입되었습니다(48).MBP 융합 단백질을 생산하기 위해 E. coli TB1 세포를 적절한 pMAL-c2 플라스미드 구조물(SI 부록, 표 S1)로 형질전환시켰다.융합 단백질을 아밀로스 친화성 크로마토그래피로 정제하고 Xa 인자로 절단했습니다.이어서, C-말단 His6-태그된 단백질을 이전에 기술된 바와 같이 Ni-고정 금속 친화성 크로마토그래피(Ni-IMAC)에 의해 정제하였다(49).유비퀴틴 융합 단백질을 생산하기 위해 E. coli TB1 세포는 적절한 pASK3-Ub-CHis6 플라스미드 구조물(SI 부록, 표 S1 및 S2)과 유비퀴틴 특이적 C-말단 가수분해효소 1(Ubp1)을 암호화하는 pCGI 플라스미드 DNA를 사용했습니다.변환(47).C-말단 His6-태그 코로나바이러스 단백질은 이전에 설명한 대로 정제되었습니다(50).

HCoV-229E nsp12-His6의 자가-NMPylation 테스트는 EAV nsp9(16)에 설명된 대로 수행되었습니다.즉, nsp12-His6(0.5μM)에는 50mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)-KOH, pH 8.0, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 6mM MnCl2, 25μM 완충액이 포함되어 있습니다. 지정된 NTP 및 0.17μM은 30°C에서 30분 동안 [α32-P]NTP(3,000 Ci/mmol, Hartmann Analytic)와 일치했습니다.nsp12 매개 nsp9 NMPylation의 다른 모든 (표준) NMPylation 분석에서 반응 조건은 50mM HEPES-KOH(pH 8.0) 존재 하에서 nsp12-His6(0.05μM) 및 nsp9-His6(4μM)과 같이 조정됩니다. ), 5mM DTT, 1mM MnCl2, 25μM은 NTP를 나타내고 0.17μM은 [α32-P]NTP와 일치합니다.30°C에서 10분 동안 배양한 후, 반응 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액: 62.5mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 HCl(pH 6.8), 100mM DTT, 2.5% SDS, 10% 글리세롤 및 0.005% 브로모페놀과 혼합했습니다. 파란색.90°C에서 5분간 가열하여 단백질을 변성시키고 12% SDS-PAGE로 분리했습니다.겔을 고정하고 Coomassie Brilliant Blue 용액(40% 메탄올, 10% 아세트산, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하고 탈색한 다음 인광 이미징 스크린에 20시간 동안 노출시킵니다(NMPylation에서 nsp12를 검출하기 위해). 또는 (최대) 2시간(nsp9 NMPylation을 평가하기 위해).Typhoon 9200 이미저(GE Healthcare)를 사용하여 화면을 스캔하고 ImageJ를 사용하여 신호 강도를 분석했습니다.

MS 분석을 위해 NMPylation 분석(SI 부록, 표 S1)에 1μM nsp12-His6 및 10μM nsp9(헥사히스티딘 태그 없음)를 사용하고 증가된 농도의 500μM UTP 및 GTP를 사용했습니다.농도와 예상되는 단백질 품질에 따라 MassPrep 컬럼(Waters)이 장착된 Waters ACQUITY H-Class HPLC 시스템을 사용하여 1~10μL의 완충 단백질 용액을 온라인으로 탈염했습니다.탈염된 단백질은 버퍼 A(물/0.05% 포름산)와 버퍼 B(아세토니트릴/0.045% 포름산)의 다음 구배를 통해 Synapt G2Si 질량 분석기(Waters)의 전기분무 이온 소스로 용출되며, 컬럼 온도는 다음과 같습니다. 60℃ 및 유속 0.1mL/분: 2분 동안 5% A로 등용매 용출한 후 8분 이내에 95% B로 선형 구배하고 추가 4분 동안 95% B를 유지합니다.

질량 범위가 500~5000m/z인 양이온이 감지됩니다.Glu-fibrinopeptide B는 자동 질량 드리프트 보정을 위해 45초마다 측정됩니다.MaxEnt1 확장이 포함된 MassLynx 기기 소프트웨어를 사용하여 기준선을 공제하고 평활화한 후 평균 스펙트럼을 분리합니다.

UMPylated HCoV-229E nsp9는 시퀀싱 등급 변형 트립신(Serva)을 추가하여 소화하고 37°C에서 밤새 배양했습니다.Chromabond C18WP 스핀 컬럼(부품 번호 730522, Macherey-Nagel)을 사용하여 펩타이드를 탈염하고 농축했습니다.마지막으로, 5% 아세토니트릴과 0.1% 포름산을 함유한 물 25μL에 펩타이드를 용해시켰습니다.

Orbitrap Velos Pro 질량 분석기(Thermo Scientific)를 사용하여 MS로 샘플을 분석했습니다.맞춤형 엔드 마운트 50 cm??를 갖춘 최고의 nanoâ HPLC 시스템(Dionex)2.4μm 자기 비드가 포함된 75μm C18 RP 컬럼(Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon 나노스프레이 소스를 통해 온라인으로 질량 분석기에 연결합니다.6 μL의 트립신 소화 용액을 300 μm 내경 ×??에 주입합니다.1cm C18 PepMap 사전 농축 컬럼(Thermo Scientific).물/0.05% 포름산을 용매로 사용하여 샘플을 자동으로 트랩하고 6 µL/min의 유속으로 담수화했습니다.

물/0.05% 포름산(용매 A) 및 80% 아세토니트릴/0.045% 포름산(용매 B)의 다음 구배를 사용하여 300nL/분의 유속으로 트립신 펩타이드를 분리했습니다. 5분 후 30A에서 몇 분 내에 45% B로 선형 변화하고, 5분 이내에 95% 용매 B로 선형 증가합니다.크로마토그래피 컬럼을 스테인레스 스틸 나노 방출기(Proxeon)에 연결하고 2,300V의 전위를 사용하여 질량 분석계의 가열된 모세관에 용리액을 직접 분사합니다. Orbitrap 질량 분석기에서 60,000 해상도의 조사 스캔이 연결됩니다. 3개 이상의 데이터 MS/MS 스캔, 30초 동안 동적으로 제외, 선형 이온 트랩 충돌 유도 해리 또는 오비트랩 검출과 결합된 고에너지 충돌 해리를 사용하여 분해능은 7,500입니다.